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    山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)試劑盒說明書微量法
    更新時間:2023-10-31 點擊量:944

    貨號:  YJS2392                                               規格:100管/96樣

    山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)試劑盒說明書

    微量法

    正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

    測定意義:

    SDH(EC 1.1.1.14)催化山梨醇脫氫生成果糖,是調控生物體內山梨醇含量的關健酶之一。

    測定原理:

    SDH催化山梨醇脫氫生成果糖,同時還原NAD+生成NADH,測定340nm吸光度增加速率可以計算SDH活性。

    需自備的儀器和用品:

    紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

    試劑組成和配制:

    提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;

    試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存;

    試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存;

    粗酶液提?。?/span>

    1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

    2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,

    加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

    3、血清(漿)樣品:直接檢測。

    測定步驟:

    1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

    2、樣本測定

    1)在試劑二中加入7.6mL試劑一和11.4mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑4℃保存一周;

    2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二,混勻,立即記錄340nm

    20s時的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。

    SDH 活性計算:

    a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

    1、血清(漿)SDH 活力的計算

    單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

    SDH(nmol/min/mL)= [ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣÷T=1608×ΔA

    2、組織、細菌或細胞中 SDH 活力的計算:

    1)按樣本蛋白濃度計算:

    單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

    SDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr)÷T

    =1608×ΔA÷Cpr

    2)按樣本鮮重計算:

    單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

    SDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

    =1608×ΔA÷W

    3)按細菌或細胞密度計算:

    單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

    SDH(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

    =3.216×ΔA

    V 反總:反應體系總體積,2×10 -4 L;ε:NADH 摩爾消光系數,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500 萬。

    b.用96孔板測定的計算公式如下

    1、血清(漿)SDH 活力的計算

    單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

    SDH(nmol/min /mL)= [ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣÷T=3216×ΔA

    2、組織、細菌或細胞中 SDH 活力的計算:

    1)按樣本蛋白濃度計算:

    單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

    SDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr)÷T

    =3216×ΔA÷Cpr

    2)按樣本鮮重計算:

    單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

    SDH(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

    =3216×ΔA÷W

    3)按細菌或細胞密度計算:

    單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

    SDH(nmol/min /104cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

    =6.426×ΔA

    V 反總:反應體系總體積,2×10 -4 L;ε:NADH 摩爾消光系數,6.22×103 L/mol/cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500 萬。

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