TB基因分型試劑盒HV-3說明書

TB Typing Kit HV-3

TB基因分型試劑盒HV-3說明書

目錄號：K2571

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組分說明

應用                      Cat. No.          YJ2571-20       K2571-50

                           Kit Size           20             50

                           VNTR3820        400 μl         1 ml

高分辨3位點VNTR檢測    VNTR4120         400 μl         1 ml

                          VNTR3232          400 μl        1 ml

DNA 分子量標準 I          MarkerⅠ           120 μl       300μl

DNA 分子量標準 II         MarkerⅡ            100 μl      250μl

其它相關產品K2570 TB基因分型試劑盒 VNTR-9

產品簡介

    本試劑盒是以分子流行病學最新研究進展1）為基礎，經工藝優化后形成的人型結核分枝桿菌基因分型產品。本產品利用結核分枝桿菌基因組中可變數目串聯重復序列（variable-number tandem repeats, VNTR）多態性進行基因型分型區分臨                                                床菌株，是研究結核分枝桿菌分子流行病學和監測結核病傳播狀況的有力工具。與現有其它基于VNTR原理的結核分枝桿菌VNTR分型系統相比，這一分型系統對中國流行的菌株具有更強的分辨能力1，2，3），因此特別適合于中國用戶的需求。

    通過對各PCR反應引物序列和預混反應液成份進行精心優化，使得本產品具有很強的抗干擾力。與用戶自配試劑相比，本產品顯著提升了特異條帶信號強度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）時非特異條帶的出現率，使實驗操作更加簡便、快捷的同時，提高了檢測成功率。本產品的預混反應液化學穩定性良好，能有效抵抗反復凍融（10次）和較長時間（一周）的室溫環境，更好地適應了用戶檢測工作中的靈活性需求。

     本試劑盒是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號 YJ2570）的配套產品。對 VNTR-9 試劑盒鑒定為成簇或相同菌株的樣本，如有必要，可使用本產品做更精細的進一步分型鑒定。本產品中的 3 個高分辨率檢測位點 VNTR3820，VNTR4120和VNTR3232 與 VNTR-9 中的 9 個檢測位點結合使用可將檢測的分辨率指數（Hunter-Gaston index，HGI)提升至 0.993                                                                                                                1）

參考文獻

1） Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium

    tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)

2） Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping

    Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)

3） Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype

    strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.

注意事項

1.  本產品是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號 YJ2570）的配套產品。待測菌株應先經過 VNTR-9 分型檢測，再使用  本產品檢測。且本產品的檢測結果應與 VNTR-9 的檢測結果進行整合分析。

2.  為避免污染，建議制備生物時與配制 PCR Mix 在不同的地點內進行，并使用不同的移液器。

3.  在樣本 DNA 的收集，抽提和擴增的所有環節都應注意作好標記，同時防止不同樣本間發生交叉污染。

4.  常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。

5.  每管 PCR Mix 中均含有不同的引物，不可混用。可根據實驗需求一次性分裝為不同的量，避免反復凍融。

6.  為避免打開反應管時，反應液飛濺，開蓋前請短暫離心，收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。

7.  吸取時注意不要交叉污染 PCR Mix，建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。

8.  實驗前準備：1×TE  緩沖液（PH=8.0）、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、普通 PCR 儀、DNA 電泳設備和凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應管、八聯排或 96 孔 PCR 管、不同規格的移液器：0.5-10 μl 和 20-200 μl。

操作步驟

1.  DNA 模板制備：

1.1  從固體培養基上刮取少量(1-2 接種環)樣本，重懸于 100 ul TE 中，80°C 滅活 30 分鐘。

1.2  滅活后的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作：

     100°C 煮沸 10 分鐘(煮沸時注意避免 EP 管蓋子爆開，避免讓水進入管中)，立即置于冰上 2 分鐘，12,000 rpm (~13,400×g)離心 10 分鐘，取上清置于另一無菌 EP 管中，做上標記，-20°C 保存。

2 .  檢測程序：

2.1  取出 TB 基因分型試劑盒 HV-3，待液體平衡到室溫后，輕微搖晃 3-4 次混勻，然后 12,000 rpm (~13,400×g)離心5秒，使蓋上的液體回落到管內。                                                                                                    2.2  三位點 VNTR 分型：對于 12 位點結果相同的菌株需進一步進行 VNTR 分型，即增加以下 4 個位點進行比較。

1）PCR 擴增：反應體系為 20 μl。

   在每個 PCR 管里分別加入 19 μl VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232 的  PCR Mix，加入 1 μl DNA 模板，混勻。

2）擴增條件：

a .  VNTR3820：

                        步驟           溫度              時間

                         預變性         95℃           10 min

                         變性            94℃             30 s

                        退火             58℃         30 s      30 個循環

                        延伸             72℃         90 s

                        終延伸           72℃         7 min

b.  VNTR3232、VNTR4120：

                        步驟             溫度            時間

                      預變性            95℃          10 min

                      變性              94℃            30 s

                     退火               64℃            30 s    30 個循環

                     延伸               72℃            90 s

                    終延伸             72℃            7 min

3）制膠、電泳：

   a：注意事項：  

   重要！每次實驗需要設置陽性（H37Rv 菌株 DNA）和陰性對照（去離子水）。

   關鍵！本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎來判讀 VNTR 位點基因型，因此，為了使結果準確，在電泳這一步必須要按照統一的標準操作，應注意以下幾點：

   a-1：制膠所用梳子為 18 孔。

   a-2：凝膠左右邊上的兩個孔由于在電泳過程中容易使條帶變形，影響結果判讀，舍棄不用，或者在其中一個孔點上陰性對照。剩余 16 孔分為 12 個樣本，3 個 DNA Marker 和 1 個陽性對照。點樣順序分別為“1，2，M，3，4，5，

         6，  M，7，8，9，10，M，11，12，H37Rv"，數字代表樣本，M 代表 DNA Marker。

   a-3：PCR 擴增產物進行第—次電泳并使用 Marker I 時，凝膠濃度為 1%，電壓為 150V，時間為 100-120 分鐘。

   a-4：如果擴增產物片段過大（>1000bp），需要再次電泳并使用 Marker II 時，凝膠濃度為 0.8%，電壓 150V，時間為150 分鐘。

   b：制膠以及電泳過程：

   使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產物進行電泳。

   配制 1%的瓊脂糖凝膠，12×12 cm 膠盤制膠，每塊膠為 80 ml。

   b-1：稱取 0.8 g 瓊脂糖，加入 80 ml 0.5×TBE，在天平上稱重后放入微波爐，高火加熱 2-3 分鐘，使瓊脂糖*溶化，搖勻，觀察為均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠的濃度不受影響。

   b-2：待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠，將溫熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。

   b-3：待凝膠*凝結（室溫下放置 40 分鐘），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液，沒過膠面 1-2 mm。

   b-4：上樣電泳：每塊膠中加入 12 個樣本（最邊上的孔不加樣），每個孔中加入 3-5 μl PCR 產物，同時每塊膠上加三個 5 μl DNA MarkerⅠ。電壓 150V，電泳時間為 100-120 分鐘。本步驟是各位點最終讀數是否準確的關鍵，需要統一按照此標準操作。

   b-5：部分位點在臨床菌株中存在擴增產物大于 1000 bp 的情況，對這些擴增產物再利用 0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，同時加入 DNA Marker II 作為條帶大小對照，電壓 150V，電泳時間 150 分鐘。

4）結果顯示：

MarkerⅠ  

MarkerⅡ

5）結果分析：

   a.  如果不同菌株的 3 個高變位點基因型也相同，可確定為成簇菌株；

   b.  如果高變位點讀數高度相似，即只有 1-2 個高變位點有差別，需結合流行病學數據鑒定是否為成簇菌株；

   c.  如果 3 個高變位點基因型都不一致，鑒定為單一菌株。

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