細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書

Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit 

目錄號：K2575   

保存：  -20℃避光保存 

組分說明

Cat.No.                 K2575

KitSize                 50

DyeingBuffer             22.5ml

25×PropidiumIodide，PI     750 μl 

產(chǎn)品簡介 

    細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidiumstaining，即 PIstaining)方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡分析的檢測試劑盒。

碘化丙啶(Propidium，簡稱PI)是一種雙鏈DNA 的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈 DNA 結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA 的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的 DNA 被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行DNA 含量測定，然后根據(jù)DNA 含量的分布情況，可以進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。碘化丙啶染色后，假設(shè)G0/G1 期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA 的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2，正在進(jìn)行DNA 復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2 之間。凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA*片段化(DNAfragmentation)導(dǎo)致部分基因組 DNA*片斷在染色過程中丟失，因此凋亡細(xì)胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染，即熒光強(qiáng)度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1 峰，即凋亡細(xì)胞峰。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞對前向角光散射的能力顯著降低，對側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化。在細(xì)胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號均降低。因此可通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞光散射的變化觀察細(xì)胞凋亡情況。

    本試劑盒通常應(yīng)用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測。如果用于組織的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細(xì)胞狀態(tài)，才可以進(jìn)行檢測。

    本試劑盒每個樣品的細(xì)胞數(shù)量可以為10-100 萬。

注意事項 

1.  本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.  需自備PBS、95%乙醇和RNaseA。

3.  熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

4.  PI 對人體有刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)。

5.  請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作步驟

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

a. 對于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1毫升冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入1ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。

b. 對于懸浮細(xì)胞：1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50 微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。

2. 細(xì)胞固定：

  取4 毫升冰浴預(yù)冷的95%乙醇，低速渦旋震蕩的同時加入 1 毫升細(xì)胞懸液，混勻后 4℃固定 2 小時或更長時間。固定12-24 小時可能效果更佳。1000×g 左右離心 3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的乙醇，以避免吸走細(xì)胞。加入約 5ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

3.PI 染色液的配制：

    參考下表，根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的PI 染色液：

         

                     1 個樣品      6 個樣品     12 個樣品 

DyeingBuffer           0.4ml        2.4ml      4.8ml 

25×PropidiumIodide，PI    15μl         90μl     180μl 

RNaseA(10mg/ml，自備)     1μl       6μl      12μl 

注：配制好的PI 染色液短時間內(nèi)可以4℃保存，宜當(dāng)日使用。

4. 染色：

    每管細(xì)胞樣品中加入400μlPI 染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴 30 分鐘。隨后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24 小時內(nèi)完成流式檢測，*好能在當(dāng)日完成流式檢測。

5. 流式檢測和分析：

    用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm 波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA 含量分析和光散射分析。



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