ELISA應(yīng)用的一些說明：克服非特異性吸附

在ELISA中，非特異性吸附是值得注意的問題，如果抗原或抗體純化不過關(guān)，產(chǎn)生非特異性吸附是實驗操作中無法避免的。

但是，即使抗原抗體的純化達到一定水平，還是有可能產(chǎn)生非特異性吸附。例如塑料載體表面的吸附，為了避免非特異性顯色，需用含Tween20的PBS或生理鹽水作為洗脫液，吐溫 （Tween）就是指聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)它與聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而進行吐溫編號，結(jié)合月桂酸的為吐溫20，結(jié)合棕櫚酸的為溫40，結(jié)合硬脂酸的為吐溫60，結(jié)合油酸的為吐溫80。在免疫酶技術(shù)中常用含吐溫20的PBS作洗滌劑或作稀釋樣品和酶標抗體（抗原）之用，它的洗滌效果要比牛血清蛋白溶液（0.5%）好，具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結(jié)合的作用。吐溫20的使用量一般在0.06%-0.1%.有學者認為，Tween20還有增強特異性反應(yīng)的作用。另外，檢測血清和酶標記抗體用含0.5%-1%牛血清白蛋白（或0.1%白明膠）稀釋也能得到增強特異性吸附的作用。樣品首先用稀釋的健血清孵育，也有助于去除非特異性顯色。除此之外，反應(yīng)的時間和掌握反應(yīng)劑zui適濃度，也有助于克服非特異性吸附。反應(yīng)一般需4~5h（25℃），如要減少反應(yīng)時間則可升至37℃，雖然反應(yīng)溫度為37℃時對靈敏性和準確性稍有影響，但是減少了保溫時間（需2~3h），對結(jié)果影響并不大，因此，37℃被經(jīng)常采用。酶標記抗體的濃度太高，易出現(xiàn)假陽性；太低，則不靈敏。所用待測樣品、酶標記抗體和抗抗體的zui適濃度，通過實驗才能獲得。在一定范圍內(nèi)，ELISA的反應(yīng)強度與待測樣品濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，通過一系列不同稀釋度的待測樣品的測定，才能得出待測樣品的zui適稀釋度范圍。另外，由于加入固相載體進行致敏的抗原量過多，因而造成的前帶（prozone）效應(yīng)，也可以通過測試抗血清的稀釋度而消除，因為在抗體zui適量的情況下，多余的抗原也不起干擾作用。關(guān)于酶標記抗體的zui適濃度，可以通過劑量反應(yīng)曲線（一系列稀釋的陽性和陰性血清，與同一濃度的酶標記抗體反應(yīng)），選擇同一稀釋度的陽性和陰性血清分別對不同稀釋度的酶標記抗體反應(yīng)而確定。陽性血清的吸收值與陰性血清的吸收值之比為zui大值時，酶標記抗體的濃度為zui適濃度。